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文献总结:克隆形成实验怎么做
来源:启达生物 浏览量:1236 发布时间:2023-05-19
克隆形成试验是一种有用的工具,用于测试给定的癌症治疗是否可以降低肿瘤细胞的克隆形成存活率。菌落被定义为至少由50个细胞组成的集群,通常只能在显微镜下确定。克隆形成试验是确定电离辐射治疗后细胞繁殖死亡的首选方法,但也可用于确定其他细胞毒性药物的有效性。以下方案已从已发布的版本中进行了修改(Franken等人,2006年)。
材料和试剂
细胞培养基
磷酸盐缓冲盐水(PBS)(启达生物,货号:SD0029)
胎牛血清(启达生物,货号:SD0200)
胰蛋白酶/EDTA
结晶紫
甲醇
冰醋酸
菌落固定溶液
结晶紫溶液
设备
细胞培养培养皿或六孔板
血细胞仪
立体显微镜
血细胞仪
恒温箱
操作步骤
1.根据参考文献选择自己所需要培养的细胞。
2.取出培养基,然后用10ml PBS冲洗细胞。
3.向细胞中加入4ml 0.25%胰蛋白酶,并在37°C下孵育1-5分钟,直到细胞呈圆形。
4.加入10ml含有10%FBS的培养基,通过移液分离细胞。
5.使用血细胞仪对细胞进行计数。
注意:获得相对准确的细胞数是至关重要的。
6.准备所需的接种浓度,然后将细胞接种到培养皿或6孔板中。
处理前电镀:
1. 收获细胞,并在6孔板上的每个培养皿或每个孔上培养适当数量的细胞,至少一式两份。用于接种的细胞数量应根据处理的侵略性来确定。在37°C的CO2培养箱中培养细胞数小时,并使其附着在培养板/培养皿上。
2. 必要时用化学物质、辐射(如2-10Gy)或两者的组合处理细胞。
3. 将细胞在37°C的CO2培养箱中培养1-3周,直到对照板中的细胞形成大小基本良好的集落(每个集落50个细胞是评分的最低值)。
处理后的镀层:
1. 处理后收获细胞。可以电镀50个或最多50 x 104个细胞。如果治疗效果不清楚,用不同数量的细胞制备系列稀释液。对于放射治疗,细胞可以在治疗后立即接种或稍后重新接种。在重新接种之前,最好将细胞放在冰上。
2. 将细胞在37°C的CO2培养箱中培养1-3周,直到对照板中的细胞形成大小基本良好的菌落(每个菌落50个细胞是评分的最低值)。
固定和染色:
1.取出培养基,然后用10ml PBS冲洗细胞。
2.取出PBS,加入2-3毫升固定溶液,将培养皿/培养板在室温(RT)下放置5分钟。
3.取出固定溶液。
4.加入0.5%结晶紫溶液,在室温下孵育2小时。
5.加入10ml含有10%FBS的培养基,通过移液分离细胞。
6.小心地去除结晶紫,将盘子浸入自来水中冲洗掉结晶紫。
7.在室温下,将碗碟/盘子放在桌布上风干几天。
数据分析:
1.用立体显微镜计数菌落数。
2.计算电镀效率(PE)和存活率(SF)。
PE=形成的菌落数/接种的细胞数x 100%
SF=处理后形成的菌落数/接种的细胞数x PE
菌落固定溶液配方
乙酸/甲醇1:7(体积/体积)
结晶紫0.5%溶液
参考文献:Yang, X. (2012). Clonogenic Assay. Bio-protocol 2(10): e187. DOI: 10.21769/BioProtoc.187.