G418和嘌呤霉素在细胞筛选中怎么选择？

G418和嘌呤霉素在细胞筛选中怎么选择？

G418和嘌呤霉素在化学性质、作用机制及在生物学研究中的应用等方面存在显著差异。

G418，是一种氨基糖苷类抗生素。它主要通过干扰核糖体的功能来阻断细胞的蛋白质合成，从而对原核和真核细胞产生毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞等。在分子遗传试验中，G418是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。当neo基因被整合进真核细胞DNA后，能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得对G418的抗性能在含有G418的选择性培养基中生长。

而嘌呤霉素则是一种氨基核苷类抗生素，是原核和真核生物中蛋白质翻译的有效抑制剂。它的化学结构与tRNA分子末端类似，能够同氨基酸结合，代替氨酰化的tRNA同核糖体的A位点结合，并掺入到生长的肽链中。然而，嘌呤霉素虽然能同A位点结合，却不能参与随后的任何反应，这会导致蛋白质合成的终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟的多肽。由于嘌呤霉素对原核和真核生物的翻译过程均有干扰作用，因此它主要被用作研究蛋白质合成的生物化学工具。

因此：G418主要通过干扰核糖体功能来阻断蛋白质合成，用于稳定转染的抗性筛选；在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面应用。

而嘌呤霉素则通过模拟tRNA分子末端来抑制蛋白质翻译过程，主要用于研究蛋白质合成的生物化学工具及筛选稳定转染的细胞株。

G418和嘌呤霉素筛怎么筛选呢？

筛选步骤来啦！

一、G418筛选操作：
1.制备筛选培养基：确定G418的最佳筛选浓度需要考虑细胞类型、生长条件以及其他环境因素，并通过实验来确定具体的浓度范围，在细胞进行慢病毒感染前用不同浓度的G418培养细胞：

2.复苏细胞：将细胞传2-3代，待细胞生长稳定后，再传代，计数，大约2000个/孔铺板于24孔培养板中

3. 以哺乳动物细胞筛选为例：

1. 用培养基将G418溶液稀释为0 ug/ml、400 ug/ml、500 ug/ml、600 ug/ml、700 ug/ml、800 ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml、1100ug/ml、1200ug/ml24孔板，每孔1ml培养基（含有G418的完全培养基），每个浓度3-4个重复.

2. .12小时后换液，将培养孔中培养基吸除，PBS洗涤一次，每孔加入不同浓度筛选培养基，隔天更换一次筛选培养基，培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准。

确定G418浓度后开始感染细胞：

3. 将需要感染的细胞铺6孔板（20万/孔），第二天转染，6小时后换新鲜正常培养基。转染24小时后加最佳筛选浓度G418培养基，隔天换液。

4. 换液一两次后（换液后培养过夜），细胞达50%-80%时，吸出所有培养液，离心3000-4000rpm，弃上清，加入2倍体积新鲜最佳筛选浓度培养液，0.22um过滤，混匀4℃备用。

5. 培养6天左右细胞大量死亡时，可以换用适应性培养基，即5中所配制。或者可以增加血清浓度培养，例如原来用10%血清，此时则可以采用20%血清。

6. .培养10天后将G418浓度减半，维持筛选压力。

7. 筛选约14天后可见有抗性xx细胞出现，采用单克隆法或者刮除阴性克隆进行细胞的培养和扩增。

二、嘌呤霉素的筛选步骤：

2.1.预实验确定细胞的最佳适应嘌呤霉素的浓度；

1) Day 1：将目的(要进行稳转株改造的细胞）细胞种于12或24孔板中；首选铺板11个孔；

2) Day2：第2天：靶细胞应该大约80-90%融合;在目标细胞的首选培养基中加入嘌呤霉素。嘌呤霉素的终浓度应为1-10μg/mL，分别为0ug/ml一孔到10ug/ml一孔，每孔的增量为1μg/mL，加入含有等浓度的嘌呤霉素培养基，并做好标记；

3) Day3+: 每隔一天换一次新鲜的含嘌呤霉素的培养基；在三到五天后导致完全细胞死亡的嘌呤霉素的最低浓度是实验中应用于选择的浓度，也可以用更精细的嘌呤霉素增量重复此滴定，以确定更精确的最佳嘌呤霉素浓度。

2.2细胞筛选

1）细胞铺板，铺两个样本，正常细胞株和感染好的细胞株各铺一孔，置37度 5%CO2培养

2）待细胞生长到60%左右的密度，加步骤2.1得出的嘌呤霉素进行筛选；

3）每天换液48-72小时后未感染的正常细胞株全部死亡，感染的稳转株正常生长，得出，稳转株构建成功.

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