我和CCK-8实验的交情

我和CCK-8实验的交情

实验之前老板都会说，要是没有想好就先点个CCK8吧，于是CCK8成了实验的首选；

先说明一下CCK8的来历：

CCK-8实验，全称为Cell Counting Kit-8实验，是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性检测的实验方法。该实验方法起源于对细胞增殖和毒性分析的需求，旨在提供一种简便、准确且灵敏度高的检测手段。

CCK-8实验的主要原理基于其试剂盒中的核心成分——WST-8（化学名为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐）。关于WST-8在CCK-8试剂中的浓度，这通常是由试剂制造商根据实验需求和优化结果来确定的，不同的商业CCK-8试剂盒中WST-8的浓度可能有所不同。

在活细胞中，WST-8能够被线粒体内的脱氢酶还原为水溶性的橙黄色甲瓒产物（Formazan）。这种产物的生成量与活细胞的数量成正比，因此，通过测量反应后溶液的颜色深浅，可以间接反映活细胞的数量和增殖情况。

CCK-8实验具有多种优点，如操作简便、省时省力、灵敏度高、线性范围宽、数据可靠且重现性好等。此外，CCK-8实验对细胞的毒性较小，无需使用放射性同位素和有机溶剂，因此更加安全环保。这使得CCK-8实验在细胞生物学、药理学、肿瘤学等多个领域得到了广泛应用，如细胞增殖速率比较、材料毒性评价、新药筛选、肿瘤药敏试验等。

CCK-8怎么做？具体的操作步骤来啦：

一、细胞数量测定

1.将细胞悬浮液（100μL/孔）接种在96孔板中。在加湿的培养箱中预培养平板（例如，在37°C、5%CO2下）。

2.向板的每个孔中加入10μL CCK8溶液。小心不要将气泡引入井中，因为它们会干扰外径读数。

3.将培养板在培养箱中孵育1-4小时。

4.使用酶标仪测量450nm处的吸光度。

二、细胞增殖和细胞毒性试验

1.在100μL待测培养基中以10^3-10^4个细胞/孔的密度在96孔板中接种种子细胞，将细胞在37°C的CO2培养箱中培养24小时。

2.将不同浓度的待测物质加入板中。

3.将培养板在培养箱中培养适当的时间（例如6、12、24或48小时）。

4.使用重复移液器向板的每个孔中加入10μL CCK8溶液。小心不要将气泡引入井中，因为它们会干扰外径读数。

5.将培养板在培养箱中孵育1-4小时。

6.在读取印版之前，重要的是在轨道振荡器上轻轻混合1分钟，以确保颜色均匀分布。

7.使用酶标仪测量450nm处的吸光度。

三、数据分析

有几种方法可以进行统计分析。您可以选择使用O.D.值或单元格编号，如下是我常用的一个计算方式：

细胞存活率（%）=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100

抑制率（%）=[（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100

As=实验孔的吸光度（细胞、培养基、CCK8和测试化合物孔的吸光度）。

Ab=空白孔吸光度（含有培养基和CCK8的孔的吸光度）。

Ac=对照孔吸光度（含有细胞、培养基和CCK8的孔的吸光度）。

四、绘制标准曲线

1.细胞计数板对细胞悬浮液中的细胞数量进行计数。

2.使用培养基，将细胞悬浮液稀释至浓度梯度，通常需要5-7个浓度梯度，每组几个重复孔。我一般重复3个，然后接种细胞。（注意每个孔的细胞数量。如果你在离心管中稀释细胞悬浮液，在加入孔板之前，需再次混匀。每个孔中细胞悬浮液的体积应该相同。）

3.孵育至细胞贴壁（通常2-4小时），然后每100μl培养基加入10μl CCK8。继续孵育1-4小时，用酶标仪测量450nm处的吸光度。以单元格数量为X轴坐标，外径值为Y轴坐标，绘制一条标准曲线。

小提醒一下：待测试样品的细胞数量可以根据曲线确定。使用此标准曲线的先决条件是培养条件相同。

T24稳转株CCK-8检测，检测浓度单位为ug/ml

CCK-8实验的坑要避一下，虽然条条大路通罗马，我们不能在去往罗马的路上掉坑里摔自己

1.确保药物和CCK8在培养基中均匀分布。

2.细胞增殖越多，颜色越深；细胞毒性越强，颜色越浅。

3.对于贴壁细胞，每孔至少1000个细胞（100μl培养基）。对于白细胞，由于其低灵敏度，每孔（100μl培养基）至少需要2500个细胞。推荐的96孔板每孔的最大细胞数为25000。如果使用24孔或6孔板进行测试，则计算每孔的相应细胞数量，并将CCK8的体积调整为每孔总液体体积的10%。

4.由于CCK8测定基于活细胞中的脱氢酶活性，因此影响脱氢酶活性的条件或化学物质可能会导致活细胞的实际数量与使用CCK8测量的活细胞数量之间的差异。

5.WST-8可以与还原剂反应形成WST-8甲氮。如果使用还原剂（如一些抗氧化剂），它会干扰测试。如果待测系统中存在更多的还原剂，则有必要将其清除。

6.孵育2小时后，背景O.D.值通常为0.1-0.2单位。

7.注意不要将气泡引入孔中，因为它们会干扰外径值。

8.如果要对CCK8溶液进行消毒，请使用0.2μm的膜过滤溶液。

9.孵育时间将根据孔中细胞的类型和数量而变化。一般来说，白细胞颜色较浅，可能需要更长的孵育时间（长达4小时）或大量的细胞（约105个细胞/孔）。

10.如果细胞悬浮液中有高浊度，测量并减去样品在600 nm或更高波长下的O.D值。

11.CCK8不能用于细胞染色。

12.培养基中的酚红不影响实验结果。计算时，可以通过减去空白孔中背景的吸光度来消除酚红的吸光度，因此不会影响检测。

13.CCK8的毒性很低。CCK8测定完成后，相同的细胞可用于其他细胞增殖测定，如结晶紫测定、中性红测定或DNA荧光测定。（除非细胞极为罕见，否则不建议使用。）

14.CCK-8试剂盒可用于大肠杆菌，但不能用于酵母菌等真菌的检测。

15.在检测孔板之前，你可以在摇床上轻轻摇一下30S也足够。

16.我们建议在平板中心附近的孔中接种细胞。最外圈孔中的介质很容易蒸发，可以用PBS、水或介质填充。

17.如果你没有450nm滤光片。您还可以使用吸光度在430至490 nm之间的滤光片，以及450 nm滤光片以获得最佳灵敏度。

18.测量450nm处的吸光度。如果需要进行双波长测量，可以将650nm处的吸光度确定为参考波长。

19.药物中金属离子的存在可能会影响CCK8的敏感性。终浓度为1mM的氯化铅、氯化铁和硫酸铜抑制了5%、15%和90%的显色反应，降低了灵敏度。如果最终浓度为10mM，它将被100%抑制.

实验证明CCK-8的灵敏度比MTS、MTT灵敏度都要高：

实验证明只有CCK-8才能让细胞存活更长：

附带WST-8吸光光谱：

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