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一看就会:BBB实验的操作步骤来啦
来源：启达生物 浏览量：104 发布时间：2025-03-19
一看就会:BBB实验的操作步骤来啦
BBB实验经久不衰，但在实际的操作却很容易出现渗漏，来看看下面的构建的步骤吧，全干货分享，点个关注，科研之途不迷路
细胞选择：HPBC(人脑血管周细胞,启达生物,货号： ）HBMEC(人脑血管周细胞,启达生物，货号： ）
培养基选择：PGM（周细胞培养基,启达生物，货号： ）ECGM(内皮细胞培养基,启达生物，货号： ）
1. 为了让原代细胞能传更多的代次，我们可以感染hTERT病毒让细胞进行永生化改造 ，根据实践永生化后的细胞可传40多代，可能SV40病毒更便宜，但是SV40感染后的细胞大部分都需要在33°增殖，而hTERT在37°就能适应。
2. 感染后的细胞需要加入Blasticidin S HCl筛选，为了保持细胞的永生化，感染后需要一直加入终浓度（f.c.）4µg/ml培养，以维持细胞更多倍增。
细胞处理好了 ，现在就开始我们的BBB实验吧：
1. 准备24孔transwell培养板，准备好ECGM内皮细胞培养基，细胞包被液，在室温中预热
2. 在超净台中拆开培养板，使用200ul包被液或者稀释好的胶原酶进行培养前的细胞板包被
3. 包被完成后，使用枪头将包被液吸出，在每个孔中加入200ul的ECGM内皮细胞培养基，并将培养板放入培养箱中预热。
4. 对实验的细胞，将其从培养箱中取出，吸出培养基，以T75为例用10mL DPBS洗涤，去除DPBS，并加入4 mL 0.05%胰蛋白酶，常温消化3-5分钟后显微镜下观察，细胞变得椭圆透亮后轻拍细胞瓶，细胞脱落，立即加入双倍胰酶的含血清的完全培养基终止消化，并1000转5分钟收集细胞。
5. 用10μL台盼蓝染色制备三个0.5mL的试管，并用细胞名称标记细胞计数室载玻片
6. 用移液管从HBMEC或者HPBC细胞悬浮液中吸取10μL，并在0.5mL试管中与10μL台盼蓝染色混合。用移液管将10μL台盼蓝染色的细胞悬浮液移到标记细胞计数室载玻片的两侧。
7. 将HBMEC和HPBC混合按照1：1混合后（500μL，密度为1.6×105个细胞/mL）接种在细胞培养孔中的半透膜（Transwell插入物）上，形成两个明确的隔室：顶部或上部隔室，可被视为“血液侧”，基底外侧或下部隔室，被视为”大脑侧“，融合的细胞的单层代表血脑屏障，为了方便后期的检测，在进行细胞定位分析时，两种细胞细胞可以与适当的物质混合[例如，CellTracker橙色CMTMR染料（541/565 nm）、红色荧光染料；
8. 隔天换液，细胞生长4天或达到100%融合，检测连接复合物形成和受限的渗透性
小细节多注意：
1. 在孔中抽吸试剂的时候，请不要触摸微孔
2. 避免在低细胞密度水平下培养（应始终将融合率保持在50%以上）
3. 换液需谨慎，以防止细胞漂浮或细胞特征的丧失
4. 应始终向每种培养基中添加Blasticin S（f.c.4µg/mL），以保持永生化基因的表达。
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1，HBMEC人脑微血管内皮细胞，货号：CD5177 人脑微血管内皮细胞是血脑屏障的主要组成成分，能够限制可溶性物质和细胞等从血液进入大脑。大脑微血管内皮细胞与外周内皮细胞相比具有一些相同特性。大脑微血管内皮细胞表面表达细胞粘附分子，调控白细胞进入大脑。由于微血管内皮细胞的器官特异性，内皮细胞通常取源于疾病研究的相关组织。, 2，HPBC人脑血管周细胞，货号：CD5022 脑瘤患者正常组织提取，黄种成人，经α-SMA免疫荧光染色，脑血管周细胞分布于脑组织的微血管系统中，调节血管形成、稳定和功能的关键因素。周细胞P3代提供，使用周细胞培养基（启达货号:P4001）细胞可达10倍增。 3，ECGM内皮细胞培养基，货号：P1001 内皮细胞培养基经10种人各部位的内皮细胞的测试和优化，经无菌，无支原体，无内毒素检测，添加肝素，内皮生长因子，胰岛素，抗氧化剂，皮质醇等组分。内皮细胞培养基是一种低血清内皮细胞完全培养基，适合血管内皮细胞和永生化的内皮细胞株。, 4，PGM周细胞培养基，货号：P4001 周细胞经常与血管平滑肌细胞(vSMC)，成纤维细胞，巨噬细胞，甚至上皮细胞的混淆，研究表明，MB因子可促进周细胞的生长， B27和N2可维持细胞的基本特征，所以本培养基除了基础和血清外，还添加了MB,B27,N2等生长因子，以满足细胞生长需求。, 5，AGM星形胶质细胞培养基，货号：P2701 星形胶质细胞培养基是专门正常原代星形胶质细胞体外培养设计的最适于其生长的培养基，血清含量2%，此培养基含有星形胶质细胞生长所需要的TGF，PDGF等生长因子，并添加抑制神经细胞生长的激素，适合大部分星形胶质细胞的生长。
