免疫组化操作步鄹和注意的细节

免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

一、洗载玻片 

二、二、用石蜡包埋组织 

三、将包埋好的组织切片，一般为5um，切片之后置于40 ℃温水中

四、捞组织

五、脱蜡，依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精每个试剂中放10min，若天气冷可适当延长时间

六、抗原修复常用的修复方法从强到弱分为高压加热修复、微波修复和胰管修复三种。高压加热修复操作简单，效果优于其它修复方法。

抗原修复的注意事项：

（1）组织不能干。

（2）选择抗原修复方法要因抗体而异。

（3）该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。

（4）抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液

七、血清封闭为了防止一抗与组织的非特异性结合，可用牛血清或山羊血清阻断这些位点。闭锁血清通常来自同一二抗动物，在室温下闭锁时间为10-30分钟。 

八、加一抗

九、加二抗

十、加SABC 

十一、加显色剂（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）   A：DAB   B：H2O2   C：磷酸缓冲液 

十二、复染

将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为半分钟，植物组织3-5min。 

十三、脱水

十四、封片

操作需要注意的事项：

1.    苏木素复染时间需要摸索，尤其阳性染色也在细胞核上。 

2.    DAB 显色时间需要达到最优化，镜下观察达到阳性染色明显但背景不太深。 

3.    抗体孵育时间和抗体浓度需要摸索。尤其一抗孵育最好在 4 度过夜。 

4.    切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但

又防止干片；用组化笔画圈时尽量画大一点，否则墨水排斥液体，引起片周边干片。