DNA提取的常见8个问题解答

质粒dna的提取是DNA技术中的必备实验技能。分离质粒DNA一般分为三个步骤：

1、培养细菌使质粒扩增

2、收集和裂解细菌

3、分离和纯化质粒

DNA碱裂解法是较常用的提取的方法，在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA(cccDNA)： 质粒的两条链没有断裂;超螺旋开环DNA(ocDNA)

而在DNA提取中总会遇到各种一些问题，导致实验无从下手，下面我们来分析一些常见的问题：

为什么用无水乙醇沉淀DNA?

乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，当加入乙醇时，乙醇会夺DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验的做法是：初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙醇，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15-30分钟即可。

在用无水乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAC或NaCL至最终浓度达0.1-0.25MOL/L?

在Ph为8左右的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAC或NaCL，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，DNA沉淀不完全，反之DNA难以收集。在沉淀的DNA过程中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液?

在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用，所以采用Tris-HCL(pKa=8.0)的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH /Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。加核糖核酸酶降解核糖核酸后，要用SDS与Kac来处理一次，可以让沉淀更佳完全。

如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA?

采用PEG(6000)沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1%左右，而小分子所需PEG浓度在20%左右

为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戌醇？

在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容光焕发器数次，加入异戌醇能降低分子表面张力，减少在振荡时气泡的产生；配比一般是氯仿与异戌醇为24：1，也可以采用酚，抽提DNA去除蛋白质时，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合(1：1)使用

为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?

因为酚与水有一定的互溶。苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris调节至PH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。

呈粉红色的酚可以使用吗?

保存在冰箱中的酚，容易和空气中的氧气发生化学反应而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以使用

怎么保存酚不被空气氧化？

加入巯基乙醇和8-羟基喹啉至终浓度为0.1%。8-羟基喹啉是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制Dnase的活性。用Tris PH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，也可以往瓶里充入氮气，防止与空气接触而被氧化。然后保存在4℃或-20℃冰箱中，可以保存几个月不会变色。