MTT实战操作—技术心得

MTT实验操作

日常中的MTT实验一般都是药敏实验和细胞增殖实验，实验的成功一般也和细胞铺板的均匀性，一致性及细胞活性惺惺相关。

MTT 溶液的配制方法：

1. MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
2. 配制MTT时用PBS（pH=7.4）溶解。

PBS配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g调pH7.4，定容1L。 

药物MTT法实验步骤：

贴壁细胞：
1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度1000- 10000 /孔，每次加入细胞的枪头贴着96孔的四周，旋转缓慢加入，加入细胞后可前后左右水平摇晃几下，以让细胞铺板更佳。

2. 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上细胞贴壁后即可加药.一般5-7个梯度，每孔100ul，一行12个孔，两个PBS填充孔，两个对照孔，两个空白孔，6个复孔

3. 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

4. 每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。

6. 每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

7. 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。

悬浮细胞：

1. 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml（细胞浓度的问题见后面的注意事项），按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ml 1640）

2. 置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

3. 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）

4. 离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。

 5. 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。

细胞增殖的实验结果计算：细胞存活率%=(加药细胞OD/对照细胞OD）x100

春节就要到了 ，祝愿大家实验越来越顺，项目基金越来越多！