平滑肌细胞怎么提取

大鼠主动脉平滑肌细胞价格3500，技术小骨瞟了一眼，说，买个90-110克的健康雄性大鼠才几十块钱，国产抗体也那么便宜，为啥不自己提？

说动手就动手，采购也不是忽悠的料，第二天，大鼠到家，小骨开始施展主动脉平滑肌细胞分离花式手法。

分离培养VSMC的方法主要有组织块贴壁法和酶消化法。

前者以器械机械剥离外膜、刮除内膜、将血管剪成1mm³的小块经细胞筛网过滤，置于培养瓶中进行贴壁培养。该方法对操作技巧要求高，剥离外膜时易有残留，刮除内膜时用力过小会有内皮细胞残留、用力过度则易刮伤中膜层。因此，初学者采用此方法进行VSMC分离时，经常有组织块漂浮、细胞培养时间过长的问题。

酶消化法则是采用蛋白酶对剔除干净周围组织的血管进行直接消化来分离VSMC。采用胶原酶、胰酶单一消化或者二酶复合消化进行VSMC分离，但是胶原酶消化时间一般需要6〜12小时不等，而胰酶对VSMC有较强的损害，消化时间不易掌握，容易消化不均匀导致对平滑肌细胞损伤较大，不易得到活性好、数量多的平滑肌细胞。

所以目前一般采用的是联合酶消化法和组织块贴壁法来提取平滑肌细胞

1. 取乙醚麻醉大鼠，迅速剪取其胸主动脉；取出后置于1-4 °C的容器中。

2.用2ml的注射器取PBS或者高压灭菌的生理盐水。反复冲洗胸主动脉，去掉其表面粘附的凝血等组织块并剔净血管的周围组织

3.然后放入酶消化液中、在37°C的气浴恒温振荡器里消化45分钟，随胸主动脉的大小和酶液活性变化略加变动。当消化过程中观察到血管变透明、周围组织成絮状可终止消化随后剥离血管外膜层、刮除内膜层和剥离中膜层；

4.含Ca2+、Mg2+的HBSS漂洗分离的中膜层，置于干净的培养皿进行快速剪碎(1-2mm³)，然后转入放有复合酶液的6孔板内进行二次消化，消化在细胞培养箱中进行，时间为I小时左右，每20分钟取出轻微晃动。消化50分钟后一般可观察到有大量细胞在组织块表面呈葡萄状暴露并开始游离出来这时候加平滑肌细胞培养基终止消化，备注：终止消化的培养基需提高血清含量到10%.

5.用1ml的注射器抽打组织消化液直至细胞基本从组织残片中脱离，再用细胞筛过滤(细胞筛孔径为40μπι)获得悬液;取滤网上的组织，重复抽打和过滤，将多次过滤后的细胞悬液一起转移到15ml的离心管里，1000转/分、离心5分钟收集细胞；

6.取含10%FBS的平滑肌细胞培养基悬浮细胞，种入6孔板进行培养。

7.新鲜分离的P0代VSMC悬浮于平滑肌细胞培养液中，于孵箱里静止培养2天，37 °C，5 %CO2。

8.48小时后观察，发现细胞已贴壁并开始铺展更换新的平滑肌细胞培养基，培养7天左右可传代 ，传代后血清降至2%的正常血清。