细胞的必须检查，您有做过吗？

文章描述了一个典型的工作流程，与细胞操作需要注意的必要步骤，为了成功地应用哺乳动物细胞系，它们必须在受控的条件下生长，并需要自己特定的生长介质。此外，为了保证一致性，必须定期监测它们的生长情况。当细胞系达到约80%的合流时，必须传代培养，以确保细胞的正常生长和健康。80%的重合性是指培养容器表面的80%被细胞覆盖。

1. 为什么我需要传代我的细胞？

细胞培养一旦开始，由于细胞数量的增加、营养物质的消耗和有毒代谢物的增加，它不能无限期地生长，最终导致细胞死亡。此外，研究人员通常对细胞要进行多次实验，因此不希望一次用完所有的细胞。传代或分裂细胞，通过去除培养基和转移细胞到新鲜的生长培养基，细胞被给予新鲜的营养同事有毒的代谢物也被去除，细胞就会被赋予新的活力继续生长。

2. 细胞生长曲线:细胞在培养液中的生长曲线由四个阶段组成:生长开始前的潜伏期(滞后期)，指数生长期(对数期)，细胞数量快速增长逐渐放缓的平稳期和细胞死亡的死亡期，这是因为缺乏营养和错误的生存条件。在对数期应更换培养基，细胞在到达固定期前应进行传代，如图1.

图1

所以培养细胞的同学请注意：

为了保持细胞的健康和积极生长，有必要更新生长培养基，并定期传代。根据细胞类型的不同，培养基在对数期可以发生几次改变。传代细胞的最佳时间是在对数期和固定期之间，即细胞达到合流之前。

1.为什么用胰酶传代细胞？

准备细胞进行传代培养的最常见方法是用胰蛋白酶等蛋白水解酶破坏细胞间的细胞与底物的连接。胰蛋白酶与乙二胺四乙酸(EDTA)结合会导致细胞从生长表面脱离。胰蛋白酶切断将细胞固定在培养皿上的局部粘连，EDTA作为钙螯合剂。

通过去除钙，参与细胞间相互作用的钙粘蛋白被破坏，细胞彼此分离。一旦从生长表面和周围细胞分离，就可以很容易地分离并在新的细胞培养皿中生长。

细胞培养条件和传代培养方法因细胞类型而异。图2描述了细胞培养过程中的基本步骤。在整个培养过程中，在一个无污染的环境中工作是很重要的。在开始、胰蛋白酶化、细胞计数和分裂后都要检查细胞。为了取得一致的结果，保持良好的记录和文件也很重要。

2.4个步骤确定细胞是否能够传代：

1. 将细胞从培养箱中取出，置于显微镜下进行快速细胞检查。细胞应该每天在显微镜下检查，以确保它们是健康的(没有污染，很少死细胞)和生长如预期。

2. 细胞应主要附着在培养皿或烧瓶的底部，而培养基应是粉橘色。pH值指示物酚红在酸化时变成黄色，这个时候需要注意了 ，有两种情况 一是细胞的密度过大，已经到了生长平顶期，二是细胞里有污染物。

3. 用显微镜拍照，记录好细胞状态对于保证实验结果的一致性非常重要。

3.传代我的细胞

1.移液器将培养基从细胞皿移到废物容器中。用5ml不含钙和镁的预加热PBS仔细清洗细胞多达三次，以去除残留培养基中的胎牛血清(FBS)。胎牛血清会抑制胰蛋白酶。

2.加入相应规格的预温胰蛋白酶/EDTA ，比如：T25瓶 1-2ml左右，轻轻旋转以覆盖培养皿底部的所有细胞。

3. 将细胞在37°C孵育2-3分钟或者室温3-5分钟使其分离。不同的细胞系需要不同的胰蛋白酶孵育时间。为避免过度胰蛋白酶作用损伤细胞，每隔2分钟在显微镜下检查一次。待细胞变得椭圆透亮后，caco-2/hepG2细胞边缘开始漂浮时，加双倍以上完全培养基中和，将细胞悬浮液转移到15ml的试管中，并以1000转/分旋转5min。

4. 抽吸上清，加2ml完全培养基重悬细胞，分瓶或者冻存。

4. 细胞计数：
1.将100µL细胞悬液与等量的0.4%台盼蓝溶液混合。台盼蓝可以选择性地穿透死细胞的细胞膜并将其染成蓝色，但不会被活细胞吸收。将盖片置于计数面上，准备血细胞计。

2. 将移液管尖端置于盖玻片边缘，将细胞悬浮液装入计数室(每个计数面积约为4µl)，轻轻排出细胞悬浮液。盖层下的区域通过毛细作用而淤塞。在大多数情况下，腔室有两个计数区，可以独立加载。

3. 将腔室置于显微镜台上，聚焦细胞。计数栅的方形图案因腔体类型的不同而不同。你在这里看到的福克斯-罗森塔尔计数室有16个面积为一平方毫米的区域，每个区域由三道线围成。每个方块又被分成16个更小的方块。计算一个16平方区域中的所有单元格，如图所示。为了避免在区域的边缘计算两次单元格，只计算正方形两边直线上的那些单元格。在本例中，应计算触及左上界限的单元格(较粗的红线)。细胞触及的下限值和右限值不应被考虑在内。将活细胞和死细胞按5个一平方毫米的矩形计数。为了进行计算，您需要将所有5个正方形的计数结果结合起来。为了提高测量精度，还可以计算计数室的额外平方.

细胞浓度的计算公式如下:

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