小鼠胚胎MEF细胞的提取和丝裂霉素C处理

小鼠胚胎MEF细胞的提取步骤：

1.将新鲜收获的胚胎放入10厘米的细胞培养皿中

2.用PBSA覆盖胚胎，取出胎盘和其他母体组织

3.切掉头顶（眼睛及以上），取出内脏

4.保存头部/卵黄囊进行DNA分离以进行基因分型检测

5.将胚胎体置于单独的10厘米板中

6.加入1mL胰蛋白酶，用刀片切碎成1mm的小碎片

7.用酒精灯火焰对样品之间的刀片进行消毒

8.将皿置于37°C培养箱中30-45分钟（倾斜，使胰蛋白酶覆盖细胞）

9.通过在每口井中添加4mL MEF培养基（通常DMEM+10%FBS+1%G/A）来抑制typsin活性。

10.用移液管10-20x吹打分离组织

11将细胞悬浮液转移到T75烧瓶或10cm平板上，并添加6-15mL MEF培养基

12.让细胞生长融合（3-4天）

13.抽出培养基，用10mL PBS冲洗

14.加入3mL胰蛋白酶，在37°C培养箱中培养5-10min

15.加入7mL MEF培养基进行中和

16.用移液管吸至离心管离心，使细胞重新悬浮

17.将悬浮液转移到2个T175烧瓶中，并向每个培养瓶中添加50mL MEF培养基

18.让细胞生长融合（3-4天）

19通过胰蛋白酶消化收获细胞，冷冻细胞@3x106细胞/瓶，注意冷冻不能密度太稀，此细胞冻存后复苏的存活会大量减少。

备注：1.在细胞培养房中执行细胞分离，并注意无菌操作，

2. 建议使用含有血清的冻存液冻存，比如我们的低血清免程序冻存液，启达货号：(SD0001）

3. 原代分离培养请使用庆大霉素/两性霉素溶液来防止细胞污染发生，启达生物货号：SD0038，P/S中的青霉素在培养基中使用含量在60ug/ml以上，会导致细胞后期产生抗生素耐药，从而影响细胞的转染。

MEF灭活处理/丝裂霉素C处理：

常用于IPS有滋养层细胞培养系统采用经过辐射灭菌或丝裂霉素C 处理的小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 滋养层，使细胞周期停滞； 这种“灭活”可防止MEF过快生长并与生长较慢的PSC进行竞争。

1. 取新的培养瓶，加0.1％Gelatin溶液覆盖预处理30分钟，用前吸掉Gelatin溶液。

2. 取需要处理的MEF细胞，以10ug/ml浓度加丝裂霉素（Mitomycin C）混匀。

3. 置培养箱中3小时。

4. 吸弃废液。

5. 用DPBS洗5遍，以完全去除丝裂霉素C。

6. 处理过的MEF加适量培养液重悬计数，以3.0×104/ cm²（MEF）铺在Gelatin处理过的培养瓶上

7. 置培养箱中静置过夜，使其贴壁

8. 铺好的饲养层在1-7天内有效，都可以支持mES生长并维持其全能性。