悬浮细胞的免疫荧光染色

小姐姐问我们销售：悬浮细胞怎么染色？启达的解决方案来啦，做悬浮细胞染色的同学们一起收藏吧。

实验步骤：

1. 收集细胞，细胞总数在1*10^6或者1*10^7左右的细胞量置于2ml的离心管中；

2. 加入2ml的PBS温和上下颠覆，800g离心5分钟，弃上清，为了完全消除血清的影响，,需反复清洗2-3次。

3. 准备好干净的载玻片，并经过明胶或者多聚赖氨酸处理，也可以购买处理好的载玻片，买来即可用于实验。

4. 用移液管吸取适量的悬浮细胞液，滴在载玻片上，并让液体自由的铺散开来，以形成一单分子层结构，并于室温下让细胞悬浮液自由干燥。

5. 用免疫荧光专用的画笔在干燥的液面边缘划圈，以免后续的操作时液体流失。

6. 滴加适量的4%多聚甲醛缓冲液，室温固定30分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。

7. 0.4%Triton-X100室温消化处理30分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。

8. 2%BSA封闭，37度，30分钟。

9. 轻轻甩去封闭液，勿洗，滴加一抗，4度孵育过夜。

10. PBS冲洗3次，每次5分钟。

11. 避光滴加荧光二抗，37度孵育30分钟（切记勿干）。

12. PBS冲洗3次，每次5分钟。

13. 加入DAPI和10ul的PBS，室温避光放置5分钟

14. 加入含抗荧光淬灭剂的封片剂封片。

THP-1免疫荧光染色（启达生物，货号：CD0122)

观察：

隔着液相在荧光显微镜下观察染色结果，如果片子比较干净，没有残留的杂质颗粒和荧光颗粒，随即用中性树胶封片。

激光共聚焦显微镜下观察染色结果。然后用专用的图像处理软件对不同激发波长下的染色图片进行叠加处理，即可得到你所要的共存图像。

K-562免疫荧光染色（启达生物，货号：CD0115)

二、悬浮细胞染色需要注意的小细节：

1. 片子处理完后，最好让它自然干燥后再开始封片，否则残留的水份或者PBS会影响封片后片子的色泽。

2. 中性树胶不宜太稠，否则到时滴在片子上后不易铺散开来。所以最好是买新鲜的中性树胶，好像不贵的，用后瓶盖盖严，并用避光纸（锡箔纸）外包，避光保存。

3. 中性树胶不宜滴加太多，一小滴即可。由于中性树胶粘性很好，所以不要用移液器或者吸管滴加，用黄色的tip头（记得要将tip头尖剪平）稍微一蘸，大概还不成滴的那种量吧，最好滴在你要观察的目的区域，但是对于细胞悬浮液样品之类的，就没有明确的目的区域了。中性树胶滴上后，要随即将盖片盖上（切记盖片要很干净哦，否则到时会前功尽弃的），否则中性树胶中的二甲苯很容易挥发，一会就变得很干稠了。

4. 最后，再次提醒，盖片盖上后，千万不要用镊子等去压盖片，否则后果不堪设想，中性胶会在盖片的重力下慢慢的均匀的沿组织片周围铺散开来。