建系or永生化

建系or永生化？

在做任何事情前，我们总会去考虑成本 ，一旦成本高于成果或者付出太大的时候，都不由自主的想要控制 科研实验也是一样 ，当成本大于成果时候，即使再好的技术，也依然受不到科研市场的认可，因此，越来越多的老师倾向于给珍贵的细胞做永生化，上期我们说了BBB实验的操作protocol，这期我们来讲讲最简单的细胞永生化，无论在良性非永久传代的肿瘤原代细胞，还是正常的组织提取的细胞它一样受用，除了预实验以外，它无处不在。

永生化（英语：Immortalized cells）是指细胞取得可突破海弗里克极限、进行无限制分裂的过程，永生化一般是端粒酶活化的结果。在肿瘤发生过程中，永生化是正常细胞转变为癌细胞的标志之一。另外，在科学研究中，有时为了研究方便，会人为诱导细胞永生化。

人为诱导细胞永生化的方法可分为物理诱导、化学诱导，以及生物学方法诱导三种。物理诱导即通过放射线照射、化学诱导是指通过致癌剂处理的方法诱导细胞永生化，而生物学诱导包括病毒感染（如SV40病毒、人乳头瘤病毒）、转入SV40病毒SV40大T抗原等方式。

永生化细胞的优势：（1)与正常细胞相比，永生化细胞系可在体外长期传代，至少在50代以上。

(2) 具有相对稳定的，与正常细胞接近的生物学性状。无致瘤性,是药物筛选，实验建模，基因研究的首选。

细胞永生化的步骤来啦，以皮肤成纤维细胞永生化，6孔板铺板为例哦 ：

1. 将原代细胞传至稳定的扩增代次，比如内皮细胞可以在第6代左右进行构建 ，成纤维细胞传代比内皮要多，所以为了节约细胞我们会在细胞的第8-10代进行永生化感染，而神经元细胞需要在分离提取后就加入猿猴病毒40大T抗原LT或者人端粒酶催化亚单位hTERT病毒。

2. 将要感染的细胞接种到六孔板，每孔细胞数为2×10^5cells，次日进行转染。

3. 转染前将培养液换为FGM低血清成纤维细胞培养基。取50μl FGM成纤维细胞培养基，分组加入0.5-0.8μg含有LT cDNA的质粒psv3-neo和含有hTERT cDNA的质粒pCl-Neo-hTERT。

4. 再吸取50μl的FGM成纤维培养基，加入1-2ul脂质体。

5. 分别室温孵育5分钟后.将两者混合，混合后在孵育10-20分钟（孵育过程中可用移液枪轻轻吹打，使其完全融合）

6. 孵育完成后，加入FGM成纤维培养基 ，扩溶至1ml左右，沿孔壁加入需要感染的细胞中

7. 将转染细胞放入37℃ CO2孵箱中培养。

8. 转染后6-10小时换为不含病毒的培养液，细胞接近汇合时，将细胞进行1：5传代，

9. 继续培养.待密度接近50％～70％时，加400ug/mL的G418进行筛选.

10. 待出现抗性克隆，滤纸法分离细胞克隆，重新接种培养；

永生化是否成功，做下以下检测就可以了：

1,将细胞和未感染的原代细胞进行传代 ，发现未感染的细胞在经历的代次中逐渐衰老

(2)核型分析:取转染并筛选后的处于对数生长期的转化细胞，进行核型分析检测;

(3)取转染后的细胞注入到裸鼠皮下，进行致瘤性检测:

(4)免疫荧光检测。

检测没有问题，恭喜您，永生化成功了， 它就是你的宝宝了 ，你可以给它取个好听的名字或者代号，也可以用它实现你的科学理想啦。

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