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MTT实战操作—技术心得

来源:启达生物  浏览量:1855  发布时间:2021-02-05

MTT实验操作

日常中的MTT实验一般都是药敏实验和细胞增殖实验,实验的成功一般也和细胞铺板的均匀性,一致性及细胞活性惺惺相关。

 

MTT 溶液的配制方法:

1. MTT 溶液的配制方法:通常,此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此,可以称取MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃避光保存即可。在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。
2. 配制MTT时用PBSpH=7.4)溶解。

PBS配方:NaCl 8gKCl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24gpH7.4,定容1L 

MTT.jpg


药物MTT法实验步骤:

贴壁细胞:
1. 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度1000- 10000 /孔,每次加入细胞的枪头贴着96孔的四周,旋转缓慢加入,加入细胞后可前后左右水平摇晃几下,以让细胞铺板更佳。

2. 5%CO237℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上细胞贴壁后即可加药.一般5-7个梯度,每孔100ul一行12个孔,两个PBS填充孔,两个对照孔,两个空白孔,6个复孔

3. 5%CO237℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。

4. 每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS2-3遍后,再加入含MTT的培养液。

5. 终止培养,小心吸去孔内培养液。

6. 每孔加入100ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

7. 同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

悬浮细胞:

1. 收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml(细胞浓度的问题见后面的注意事项),按次序将补足的1640(无血清)培养基40ul Actinomycin D(有毒性)10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20)需检测物10ul细胞悬液50ul(即5×104cell/孔),共100ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对照(加100ml 1640

2. 37℃5%CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。

3. 每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4 h。(悬浮细胞推荐使用WST-1,培养4 h后可跳过步骤4),直接酶联免疫检测仪OD570nm630nm校准)测量各孔的吸光值)

4. 离心(1000x10min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm630nm校准)测量各孔的吸光值。

 5. 同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定3复孔。

细胞增殖的实验结果计算:细胞存活率%=(加药细胞OD/对照细胞ODx100

春节就要到了 ,祝愿大家实验越来越顺,项目基金越来越多!

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