IP/Co-IP 操作方法

1. 用冰冷的PBS缓冲液洗涤两次在组织培养盘或瓶內贴壁的细胞，之后排掉PBS。并且也用PBS洗涤非贴壁细胞，接着在桌面型离心机中，用转速800 - 1000转/分钟去离心5分钟，以沉淀细胞。

2. 添加冰冷的RIPA改良缓冲液至细胞（加1毫升至每10 ⁷个细胞/100 mm组织培养盘/150平方厘米组织培养盘瓶，加0.5毫升至每5 × 106个细胞/60mm组织培养/75平方厘米组织培养瓶）。

3. 使用已在冰的蒸馏水中冷却之一个橡皮淀帚或塑料细胞刮棒，于组织培养盘或瓶內，刮下贴壁的细胞，并且转移该细胞悬液到离心管中。

4. 将离心管放置在摇床恒温箱或定轨振荡器上，并于4摄氏度轻轻摇动该悬浮液15分钟，以裂解细胞。

5. 之后，使用已经预冷的离心机，以14000 × g离心细胞裂解物15分钟。完成后，立即将上清液转移到一个新的离心管中，并弃去旧离心管的沉淀物。

6. 当制备蛋白A或G琼脂糖（或琼脂糖凝胶）时，用PBS清洗琼脂糖珠粒两次，并维持50％的浆料在PBS中。于操作琼脂糖珠粒过程，我們建议以切断尖端的吸管去操纵，以避免珠粒的分裂破坏。

7. 于每1 ml细胞裂解物中加入100微升蛋白A或蛋白G的琼脂糖/琼脂糖珠粒浆（50％），以预澄清该细胞裂解物；为此，放置在摇床恒温箱或定轨振荡器上，在4摄氏度下培育10分钟。预澄清的细胞裂解物，将可以减少在稍后测定实验使用时，因细胞蛋白质与琼脂糖/琼脂糖凝胶的相互作用，所产生的非特异性结合。

8. 以在4摄氏度离心14000 x g 10分钟去移除蛋白A或蛋白G珠粒，并将上清液转移到另一个新的离心管中。

9. 要确定细胞裂解物的蛋白质浓度，可以如通过Bradford进行测定。但注意，测定蛋白质浓度之前，该细胞裂解物至少要1:10倍稀释，因为在裂解缓冲液中的洗涤剂，会受到考马斯基试剂的干扰。

10. 用PBS稀释细胞裂解物的总细胞蛋白量至约1微克/微升，以减少在缓冲液中洗涤剂的浓度﹔然而，若是一个低蛋白貭量水平的细胞模型，可能必要有更浓缩的细胞裂解物（即10微克/微升）以免疫沉淀该蛋白貭。此时，添加推荐量的免疫沉淀抗体（参见数据表的详细信息）到500 ul的细胞裂解液（即500微克）。但若要得到免疫沉淀任何目的蛋白质应使用抗体的最佳量，那必要根据對每个细胞模型的实验经验去确定。

11. 在室溫中以摇床恒温箱或定轨振荡器，轻轻摇动细胞裂解物 - 抗体混合物2小时，或在4摄氏度摇动过夜。以室溫摇动培育2小时，是被推荐用于免疫沉淀有活性的磷酸激酶或磷酸水解酶的培育的时间。

12. 通过加入100 ul的蛋白A或G琼脂糖/琼脂糖珠粒浆液（等同50 ul紧压珠粒），和在摇床恒温箱或定轨振荡器室溫中轻摇1小时，或在4摄氏度轻摇过夜，将可以捕获蛋白質 - 抗体免疫复合物。在许多情况下，如果额外添加2 ul的桥连抗体（例如：兔抗小鼠IgG），我们能够增强捕获该免疫复合物的能力。这方法对于一些结合蛋白A不良的抗体，譬如小鼠IgG1或在鸡的抗体尤其重要。

13. 然后，通过脉冲离心（即在14,000rpm下离心5秒）去收集琼脂糖/琼脂糖珠粒。弃去上清液，并用800 ul冰冷的改良RIPA缓冲液冲洗珠粒3次。偶尔，用此改良RIPA缓冲液冲洗琼脂糖/琼脂糖珠粒，会剥离掉结合其上的蛋白質 - 抗体免疫复合物。在这情况下，推荐用温和的PBS缓冲液去洗涤。

14. 最后悬浮琼脂糖/琼脂糖珠粒在60 ul 浓度2倍的样品缓冲液中，并轻轻混匀；这悬浮液将足够使用于三个电泳的泳道。将琼脂糖/琼脂糖珠粒煮沸5分钟，以从珠粒上解离其蛋白質 - 抗体的免疫复合物。再以离心收集珠粒，而用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测上清液。或者将上清液转移到一个新的离心管中，并在摄氏-20度冷冻贮存，供以后使用。如是冷冻的上清液应直接再煮沸5分钟，才作凝胶电泳。

二：需要注意的节点:

1.如果使用预先已经制备的细胞裂解物，请由第5步骤开始。

2.大多数免疫沉淀实验需在 4℃下进行，同时依据实验目的提前将蛋白酶抑制剂和或磷酸酶抑制剂添加到裂解液中

3.IP/Co-IP 实验的成功与否与蛋白样品质量（抗原质量）息息相关，选择合适的蛋白制备方案，提高蛋白样品质量是实验的成功必要条件。