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GFP标记的应用和载体系统

来源:启达生物  浏览量:734  发布时间:2021-06-18

绿色荧光蛋白(GFP)等蛋白质的生物发光和荧光可能在水母等生物中存在了数百万年;然而,直到20世纪60年代,科学家们才开始研究GFP并推断其生化特性。现在,GFP及其荧光衍生物已成为实验室的主要研究对象。GFP被广泛应用于生物学领域的研究,科学家们利用GFP实现多种功能,包括:标记基因以阐明其表达或定位特征,充当生物传感器或细胞标记,研究蛋白质之间的相互作用,可视化启动子的活动,等等。

为什么是绿色荧光蛋白?

 

GFP是一种约27kda的蛋白质,由238个氨基酸组成,来源于水晶水母aequoreavictoria。它在可见光谱的绿色部分具有荧光发射波长(因此得名),这是由于蛋白质中心的三种特定氨基酸(Ser65Tyr66Gly67)的成熟反应形成的生色团。当第一次被发现时,GFP最令人惊讶的一个方面是发色团是自发形成的,没有额外的辅助因子、底物或酶活性,它只需要在成熟过程中有氧存在。这意味着蛋白质可以直接从A到B,并在任何生物体中表达,同时仍保持荧光。

 

1996年首次报道的蛋白质结构是11β-包含“Barrel”形的薄片,发色团隐藏在结构的中心,不被水溶剂淬火。这种紧密排列的结构解释了整个GFP蛋白的重要性,它几乎完全是维持荧光活性所必需的;与当时的传统荧光染料相比,GFP的主要优势在于它无毒,并且可以在活细胞中表达,从而可以研究动态的生理过程。

 

重新设计GFP以增加其颜色和应用范围

几乎在它的序列被阐明之后,科学家们就开始通过突变来改造GFP的新版本,以改善其物理和生化特性。1995年,罗杰YTsien描述了一个S65T点突变,它增加了GFP的荧光强度和光稳定性。这也将其主要激发从395nm移到了488nm,有效地改善了野生型蛋白的缺陷,促进了其在研究中的广泛应用。许多其他的突变已经被引入到GFP中,新的荧光团不断被设计。下表1列出了几种常见的荧光蛋白及其相对于野生型GFP的突变。虽然这里没有列出,但每种颜色中的许多渗透也存在,它们之间只有细微的差别。

 

请注意,在光谱的红色部分发现的许多荧光蛋白不是GFP衍生物,而是与从Discosoma sp.分离的dsRed蛋白有关。已经做了类似的工作来扩展红色荧光蛋白库;然而,这些蛋白质是独特的绿色荧光蛋白和突变定义中发现的表2可能不适用。

表1:包含普通荧光团的特异性突变

 

表二:GFP衍生物特异性突变的功能作用

 

多种应用

由于GFP及其易用性,GFP等荧光蛋白已成为分子生物学的主流。科学家可以很容易地利用含有GFP的质粒作为一种手段,达到许多功能目的,以下是一些常用的用途,但是目前还有许多其他的用途,并且新的GFP技术正在不断发展!

 

融合标记GFP是最常见的用途之一,它可以与蛋白质的N-C-末端融合,这使科学家能够可视化基因表达的时间和地点。

 

转录报告员:将GFP置于感兴趣的启动子的控制下,可以用来有效地监测特定细胞类型中启动子的基因表达。这种转录报告是GFP最早的应用之一。

 

Förster共振能量转移(FRET):这是用来研究两个蛋白质之间的相互作用,或在两个蛋白质域之间发生构象变化的相互作用。典型地,使用了两种具有重叠激发/发射光谱的荧光蛋白;融合到每个正在测试的蛋白质或域的一个。在这里找到微动质粒。

 

分裂EGFP作为一种替代fet的方法,拆分EGFP也被用来研究蛋白质与蛋白质的相互作用。在这种情况下,EGFP的两部分融合到感兴趣的蛋白质中,当它们接近时,EGFP的两部分经历折叠、成熟和荧光。

 

生物传感器:采用FRET、钙调蛋白等多种策略,设计了一系列基于GFP的荧光生物传感器,用于检测各种细胞内条件,包括离子(如Ca2+)浓度和pH等。

光遗传学:科学家可以利用光来检测、测量和控制分子信号、细胞和细胞群,以了解它们的活动,并可视化改变对这种活动的影响。了解更多关于光遗传学的开放式光遗传学,并在Addgene找到光致执行器和传感器。

 

细胞标记/选择:表达结构如质粒通常包括GFP作为标记,以帮助识别哪些细胞成功地获得了质粒。这可以作为选择抗生素的替代品。这种类型的质粒可能在感兴趣基因的附加启动子的控制下,或与感兴趣基因相同的转录子表达GFP,但在内部核糖体进入位点(IRES)之后。这通常用于FACS的连接(见下文)。

 

荧光活化细胞分选(FACS:这是一种流式细胞术,它根据荧光信号将细胞混合物分离成不同的群体。因此,FACS可以用于将表达GFP的细胞与非GFP的细胞分离。

 

发育/转基因用途GFP由于其稳定性,可用于细胞命运研究中的遗传跟踪能力。当利益促进者控制时,它也可以用来形象地显示这些促进者活跃的发展阶段。此外,GFP还可以标记经转基因ES细胞,然后可用于转基因小鼠的植入和生成。

 

纯化GFP可作为蛋白质纯化的一般表位标记,并可获得大量的GFP商业抗体。

 

其他:我们只是在为GFP的潜在应用程序的表面划伤了一下。它还被用于在药物筛选中识别特定细胞群,在癌症研究中可视化裸鼠的微转移,充当DNA双链断裂修复的报告员,并标记致病性细胞内微生物,以可视化宿主/病原体相互作用

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