实验不踩坑，全步骤的细胞侵袭实验

一、材料准备

　　可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的Transwell,迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清的基础培养基，正常的完全培养基,无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1%PBS结晶紫)

　　二、步骤和流程

　　1.用BD公司的Matrigel 1:8或者根据细胞产生mmp的量来决定稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。

　　2.制备细胞悬液前可先用只加1%血清的完全培养基让细胞饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。

　　3.消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含0.1%的BSA的无血清培养基重悬及调整密度，通常调整细胞密度至5×10^5cells/ml。

4. 取细胞悬液100μl加入Transwell上室,　也可以根据细胞生长速度进行调整，操作小提示：接种剂量不同的细胞，其侵袭能力是不同的，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，最后会难以统计结果;而细胞量过少，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，进入下室。因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。

5. 24孔板下室一般加入600μl含生长因子或血清的完全培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就会减弱甚至消失,种板时一旦出现气泡,要将小室提起去除完气泡,再将小室放进培养板。若是平行孔，一般设置两组。

　　6.培养细胞:常规培养12-48h(主要依细胞侵袭能力而定)。24h较常见,时间节点的设置除了要考虑到细胞的侵袭力外,处理因素以及细胞数目的影响也不可忽视。

三、结果统计步骤：

1. 采用直接计数法,取出Transwell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。

　　2. 0.1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,注意不要蹭到已穿膜的那一层细胞，之后再用PBS洗3遍。

3. 400倍显微镜下每个样本取6-10个视野观察细胞计数，取平均值，统计分析