培养细胞遇到“水逆"，我们该如何应对

   细胞间总是有很多奇特的事情发生，比如说同一个培养箱里的细胞，为什么别人的好好的，我的却一直有问题，不是污染就是死亡，要么就是停滞不长，人家三天换液一次，照样传代冻存实验，我三天换液也不行，每天换液也不行，水逆期该如何对付？

   这是一个复苏第二天的细胞，感觉真的是找不到问题，一直觉得水逆期过去了，光明终于来了，开开心心的换了个液，准备第二天传代。。。

   但是24小时之后再观察细胞状态，就变成下面的样子了，所有贴壁细胞都聚团漂浮起来，而且背景下还有很多细小的砂砾状黑色颗粒，PBS怎么洗也洗不掉，很明显这个细胞也泡汤了。

   如果细胞被细菌污染了，培养皿或瓶中的细胞状态很快就会发生变化，表现为胞浆中出现大量的颗粒，液体浑浊、培养基PH下降，变成黄色，贴壁细胞形态变圆、会脱壁死亡；而受到真菌污染的细胞，细胞状态并不会马上发生变化，培养3-4天后，你可能才会在培养皿中看到白色的漂浮物或者黑色的小点儿，只有两种可能性，一种就是细胞污染，另一种培养箱内部温度不均衡，需要放个其他的细胞到那个位置测试一下。

   但很奇怪的是，实验室里养这个细胞的并不是只有一个人，其他人的细胞无论是一样的或者别的细胞都挺好的，只有这个同学复苏，传代亦或是从别人那里刚借来的细胞都死翘翘了，搞得她一个月不敢养任何细胞，也导致整个实验室的人都在帮她找污染的原因。

开启污染大排除

   首先，我们使用的都是同一种血清、双抗和培养基，如果是上述哪一种出现问题，那么应该是所有的人细胞都出问题了才对，排除试剂问题。

其次，她每次使用前都会把需要使用的耗材放在超净台中紫外照射30分钟以上，所以也不会是使用耗材造成的污染，排除耗材问题

   最后我们把目光集中到了细胞间水浴锅和服装穿戴上。因为最近除了这个倒霉的同学以外，其他人都没有复苏细胞。而这同学为了方便，将水浴锅搬到了缓冲间的自来水龙头下，水浴箱里的水就是水龙头里的自来水，里面竟然还飘着只死蚊子…..而这位同学自从进了细胞间以后，大耳环手镯就没有离身过，白大褂也没有洗，袖口都黑的发亮了，即使细胞间的白大衣常年被紫外照着，可能也依然逃不掉有污染的痕迹。。。

   所以，在这样的日常操作下，细胞不死都怪了。细胞培养过程中，无论是配制试剂还是水浴锅中用于细胞复苏的水，都需要使用超纯水；并且，即使冻存管是使用封口膜封存的，也要在超纯水中复苏才可以。

   与此同时，人员流动也是细胞间无法控制的污染原因之一。人员流动本身就会携带很多灰尘，而细菌就会附集在灰尘之中，细胞间的无菌服除了需要定期清洗更换外，在穿着上也有要求。勤洗澡，勤换衣，女生尽量少带首饰为好。

细胞培养遇到污染处理的办法

   如果是细菌污染，还没有大爆发，污染较小，可以把我们的G/A和PS分别加入培养液中，以100ml培养基为例：加入G/A 0.75ml,加入PS:0.5ml ，24小时后换液。连续杀两天后，细胞黑点减少，再使用回来正常的抗生素浓度。

   有时候培养的一些细胞株镜下可见细胞质中有多个空泡，有人说，细胞不一样所以看到的形态和特征也不一样，比如说内皮细胞是一种“很脏”的细胞，因为在培养过程中细胞之间的挤压和叠加，视觉下会看到很多圆形结构。这种情况不一样，细胞质和细胞核中出现很多空泡，这是很明显的异常显现，但即便如此培养基的颜色并没有发生变化，细胞仍在继续分裂生长，只是形态发生变化拉长而已。

   这种情况基本上可以判定是支原体污染了。细胞受到支原体污染后比真菌污染更难发现。最开始的阶段，细胞不会发生任何变化，培养基的颜色和细胞状态都不会有任何差别。当你传代几次之后，你会发现细胞生长速度缓慢，形态开始老化。如果不仔细观察细胞内部的变化，我们很容易将其归结于由于个人处理不当导致的细胞老化。这也提醒我们一点，日常观察细胞状态如何，不只是看有没有细胞死亡这么简单。

   支原体污染后的细胞，高倍镜下可见细胞核或胞浆内会出现大小不等的空泡，细胞经常表现出一种突然暴毙的状况，而我们也很难找到具体是在哪一阶段感染了支原体。所以即使在这期间冻存细胞，再次复苏后，仍会有支原体污染的情况存在，支原体污染影响的不仅是细胞形态和生长速度，也会改变细胞的自身的特性，诱导染色体发生改变，所以即使细胞没有死，也一样会对实验结果产生影响。

   支原体污染推荐使用支原体清除剂（启达生物,货号：SD0033）采用小分子抗生素和广谱抗生素结合配制，可清除99%以上的不同的支原体污染，支原体和细菌或真菌污染还有所不同，一旦发现支原体污染，很可能是一个孵箱或一个实验室的整体问题，而不是个人情况。所以为了预防支原体污染和扩散，最好的办法就是一经发现马上把发现的有的细胞隔离起来并清理消毒培养箱及细胞间。

    还有就是黑胶虫污染，和发现支原体污染一样，需要迅速对实验室和细胞培养房进行消毒，后，珍贵细胞隔离培养采用黑胶虫抑制剂(启达生物,货号：SD0036)清除。

   除了上述说的三种问题，还有一种是细胞间的不可抗力—有些人某一时间段养什么细胞都会死，排查了所有可疑点，都找不到污染原因。如果真的遇到这样的情况，可能这是真的水逆期到了，建议给自己安排点其他的事情做做，做完后再来养细胞，可能就没有问题了。