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HUVEC细胞的提取

来源:启达生物  浏览量:10289  发布时间:2022-07-20

内皮细胞有较多生物学功能,可应用于动脉粥硬化的血管重塑,减轻血管损伤,预防心血管疾病;缓解糠尿病患者下肢缺血症状,防止非创伤截肢的发生;此外,内皮细胞在以血管生成为靶向的药物研究以及组织再生、创面愈合方面均有正面报道。

脐静脉内皮细胞的分离方法包括:机械刮取、组织块移植、组织消化后磁珠分选法和胶原酶灌法。前两种方法细胞阳性率较低,第三种方法成本较高,目前均以第四种方法为主

准备材料:新鲜的脐静脉15-20cm,ECGM培养基,DMEM基础,II型胶原酶、0.25% 胰酶-EDTA、胎 清、青 素、链 ,明 胶,兔抗人 VIII因子抗体、FITC标记山羊抗兔-IgG

 

操作方法如下:

1.无菌取新鲜脐带 15 cm 左右, 投入无菌的PBS 液中。在超净工作台内, 取出脐带, 用止血钳夹 住脐带两端, 投入体积分数为 75% 的酒精中浸泡约 60 s,取出。

2.将脐带放置于大平皿中,挤去血液,用巴氏吸管吸弃,剪去血肿多的和有夹痕的脐带段。脐带的一端剪断,暴露出两条脐动脉和一条脐静脉(脐动脉壁厚,管腔小,静脉壁薄,管腔大)。输液延长管适当长度,插入脐静脉3cm 以上,止血钳固定。从延长管的一端用20mL注射器吸取PBS冲洗脐静脉,吸弃洗液。

3.将脐带转移至新的平皿,结扎另一端脐带,向脐带注入体积为1mL/1cm胶原酶溶液胶原酶溶液浓度为:1mg/ml,使用DMEM配制),充盈脐静脉,止血钳封闭端口,室温下消化 15-20分钟,并不时上下摇动脐带。

 4.消化完后,将下端结扎的止血钳松开,消化液流入一个 50 ml 无菌离心管中,用无菌的 PBS 溶液冲洗脐带 2-3 次。

5.将收集到的悬液1000转5分钟离心获得细胞悬液;

6.弃上清,使用额外提高血清到15%的ECGM内皮细胞培养液重悬细胞,接种于0.02%明胶预包被的T25培养瓶,于37℃、5%CO2 培养箱中培养.

7.诱导贴壁24-48小时,全量换液,血清降为正常培养5%的浓度,去除未贴壁细胞,添加正常培养的新鲜ECGM内皮细胞培养基,一套搞定细胞纯化问题,隔天全量换液,待细胞融合度达80-90%时,用0.05-0.1%EDTA胰酶消化传代,得到人静脉内皮细胞HUVEC

8.采用vWF抗体免疫荧光法鉴定 HUVEC细胞,具体操作如下:从培养板中取出细胞爬片,PBS洗3次,4%多聚甲醛固定15min; 0.2%TritonX-100破膜;10%山羊血清室温封闭30 min;加入兔抗人vWF抗体(1∶100稀释),放入湿盒内,37℃,60min;加入FITC标记山羊抗兔-IgG, 37℃避光孵育60min;5μg·mL-1的 DAPI室温衬 染细胞核2min,荧光显微镜下观察。

如下图:

图片1.png 

参考文献研究发现孵育10min时,内皮细胞并未完全脱落,细胞数量较少;孵育20min时,不仅内皮细胞脱落,平滑肌细胞也部分脱落,给后期纯化培养造成困难。最佳孵育时间是15min,此时,内皮细胞消化完全,且没有杂细胞的污染。

本文参考文献:

1]EstablishmentandOptimizingoftheMethodofIsolatingandCulturingHumanUmbilicalVeinEndo- thelialCellsinVitro

1671-8151(2015)03-0285-05

2]SiowRC.Cultureofhumanendothelialcellsfromumbilicalveins[J].MethodsMolBiol,2012,806:265-274.

3]严凤英,于萍,关林波,等.原代人脐静脉内皮细胞分离培养方法的探讨及其鉴定[J].华西医学,2010(4):727-729.

 


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